结核分枝杆菌蛋白酶体辅助因子PafC在氟喹诺酮类药物莫西沙星耐受中的作用

【摘要】结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis,简称结核菌）引起的全球性感染性疾病。据世界卫生组织报告,全球三分之一的人感染过结核菌,而仅在2012年结核病患者就有860万,全球结核病死亡人数高达130万。结核病疫情如此严重,除了其致病菌结核菌的独特致病特性外,多重耐药结核（multi-drugresistanttuberculosis,MDR-TB）和广泛耐药结核（extensivelydrugresistanttuberculosis,XDR-TB）的出现以及和结核菌与人类免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus,HIV）共感染,使得结核病疫情更加难以控制。目前治疗结核病的一线药物包括异烟肼（Isoniazid,INH）.利福平（Rifampicin,RIF）、吡嗪酰胺（Pyrazinamide,PZA）以及乙胺丁醇（Ethambutol,EMB）对MDR-TB和XDR-TB患者无效。因此二线抗结核药物氨基糖苷类抗生素、多肽类抗生素和氟喹诺酮类抗生素作为MDR-TB和XDR-TB患者的主要药物。其中氟喹诺酮药物因具备低毒副作用和大量的衍生物的特点而倍受重视。然而,针对氟喹诺酮药物的耐药菌的不断出现使得结核病防控雪上加霜。因此,我们试图寻找分枝杆菌耐氟喹诺酮药物的新机制,将相关基因作为潜在的氟喹诺酮药物增效剂靶点,为解决MDR-TB和XDR-TB的药物开发提供基础。本实验之前的工作初筛到了一株对莫西沙星超敏感的耻垢分枝杆菌（Mycobacteirumsmegmatis）突变株M371,并鉴定了转座子插入的位点。本课题将进一步验证突变株M371超敏感的表型及其机制,并初步探索突变株在胁迫反应中的作用。首先,采用8倍野生型耻垢分枝杆菌最小抑菌浓度（minimuminhibitoryconcentration,MIC）的莫西沙星处理耻垢分枝杆菌野生型和突变株M371,记录处理不同时间后的菌落形成单位（colony-formingunit,CFU）,计算存活率并作杀菌曲线,验证突变株M371的莫西沙星超敏感表型。然后,为了研究基因MSMEG3888在耻垢分枝杆菌在天然耐受（intrinsicresistance）莫西沙星中的作用,构建突变株M371的回补菌株。而MSMEG3888结核菌H37Rv中的对应基因为Rv2095c。将基因Rv2095c克隆并连接到穿梭质粒pALACE上,并将重组质粒pALACE-Rv2095c电转化入突变株M371,获得回补菌株。并采用Western-blot检测回补菌株中基因Rv2095c的表达和MIC实验判断对莫西沙星的敏感性。最后,探索突变株M371、野生株和回补菌株在表面性质方面的差异,并以过氧化氢（hydrogenperoxide,H2O2）及十二烷基磺酸钠（SodiumDodecylSulfonate,SDS）模拟肺泡的环境来研究三株菌的胁迫反应。实验结果表明：耻垢分枝杆菌突变株M371的经莫西沙星处理存活率比野生型低,为莫西沙星超敏感表型。通过菌液PCR验证和基因测序,证明了成功构建了回补菌株M371-pALACE-Rv2095c。Western-blot验证了Rv2095c异源表达成功,并且回补菌株与野生型具有相同的耐受能力。由此证明了基因MSMEG3888参与对莫西沙星的本底耐受。在生物表面性质方面,耻垢分枝杆菌野生型、突变株M371和回补菌株,三者在单菌落形态和滑动能力方面无明显差异；但在脂质系数方面差异明显,突变株较野生型明显下降。三者在SDS耐受水平无显著差异,突变株较野生株在双氧水耐受水平亦无明显差异。三株菌在胁迫应答中无明显差异。因此,本研究证明了基因MSMEG3888的参与天然耐受,基因MSMEG3888并不影响耻垢分枝杆菌的表面性质,亦不参与胁迫应答。
【作者】毛金校；
【导师】谢建平；
【作者基本信息】西南大学，微生物与生化药学，2014，硕士
【关键词】蛋白酶体辅助因子；分枝杆菌；MSMEG3888；Rv2095c；天然耐受氟喹诺酮类药物；莫西沙星；

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